Cinética de Michaelis-Menten de la β-galactosidasa con UV5Bio LabX®

Introducción
La β-galactosidasa es una exoglicosidasa que hidroliza el enlace β-glicosídico formado entre una galactosa y su mitad orgánica. En este artículo el sustrato o-nitrofenol-β-D-galactósido (ONPG) se hidroliza a o-nitrofenol (ONP) y galactosa. El ONP absorbe la luz a 420 nm, pero el ONPG no: 

En bioquímica, la cinética de Michaelis-Menten es uno de los modelos más conocidos de cinética enzimática. Recibe su nombre por el bioquímico alemán Leonor Michaelis y el físico canadiense Maud Menten. El modelo adopta la forma de una ecuación que describe la tasa de reacciones enzimáticas al relacionar la tasa de reacción v con [S], la concentración de un sustrato S. Se explica mediante la fórmula: V = d[P]/dt = Vmax*[substr]/(Km+[substr])

Figura 1: determinación de la pendiente (KM) y la intersección (Vmáx) usando vectores. El resultado 1 equivale a las tasas iniciales, mientras que el resultado 3 corresponde a los valores de v/[sustr].

Vmáx representa la tasa máxima que el sistema puede lograr cuando se saturan las concentraciones de sustrato. Esto significa que las concentraciones de sustrato superiores no aumentan más la tasa de reacción. La constante de Michaelis-Menten KM es la concentración de sustrato a la que la tasa de reacción es igual a Vmáx/2. KM se suele expresar en mM. Usando la curva lineal de Eadie Hofstee, KM y Vmáx se determinan directamente a partir de la pendiente (KM) y la intersección de y (Vmáx) trazando v frente a v/[sustr]: 


Desarrollo del método
Se creó un método que solicita al usuario que añada el sustrato y después la enzima, con el fin de que inicie la cinética para cada análisis. Tras el cálculo de las constantes de tasa iniciales para diferentes concentraciones de sustratos, el método calcula vmáx y KM usando los denominados vectores para v y v/[sustr] en el método. Dichos vectores (pares de valores de y;x) se pueden definir mediante el software LabX (figura 1).

Tabla 1: Constantes de tasa inicial y v/[s] para diferentes concentraciones de ONPG.

Es posible acceder a todas las fórmulas relacionadas con una regresión lineal en el editor de fórmulas del software LabX. El resultado 1 equivale a las tasas iniciales, mientras que el resultado 3 corresponde a los valores de v/[sustr]. La pendiente (y;x) y la intersección (y;x) se calculan directamente en el método. La curva de Eadie Hofstee se muestra en la figura 2. Una vmáx de 2,7 * 10-3 DO/s (162 mDO/min) y un KM de 0,0944 mM se obtuvieron a partir de la regresión lineal (curva de Eadie Hofstee).

Figura 2: Curva de Eadie Hofstee de la cinética de la β-galactosidasa con ONPG como sustrato.

Estos resultados concuerdan con la KM determinada previamente en tampon Tris con pH 7,6 y a temperatura ambiente.

Esta configuración se puede usar fácilmente para comprobar diferentes sustratos y/o inhibidores de beta-galactosidasa y diferentes tampones. Con un CuvetteChanger y pipetas multicanal resulta posible realizar un análisis cinético completo, incluida la evaluación, en un experimento.