Tu suplemento de purificación de vitaminas
Bart analiza cómo adaptar los métodos de cromatografía a las aplicaciones de vitaminas en su última publicación.
Las vitaminas pueden ser micronutrientes, pero son de gran importancia cuando se trata de nuestra salud. Debido a que son tan esenciales para casi cualquier función corporal, la investigación y el procesamiento de vitaminas siempre ha sido y sigue siendo un campo muy popular en productos farmacéuticos y biotecnología. Es hora de que también complementemos nuestro blog con vitaminas. ¡Esperamos que una discusión sobre la purificación de vitaminas no sea una píldora demasiado difícil de tragar para usted! Pero compruébelo usted mismo y siga leyendo.
Normalmente la mayoría de nosotros obtenemos todas las vitaminas que necesitamos de una dieta equilibrada y del medio ambiente. Pero hay muchos casos en los que los suplementos vitamínicos pueden ser beneficiosos. Podríamos enumerar a los que viven inviernos oscuros donde la deficiencia de vitamina D podría ser un problema, las personas con afecciones médicas o las que siguen dietas estrictas, por nombrar algunos ejemplos.
Después de todo, necesitamos vitaminas para curar heridas, estimular nuestro sistema inmunológico, regular nuestro metabolismo, reparar el daño celular y mucho más.
Debido a su importancia, la investigación de las vitaminas es un campo muy popular. Las vitaminas pueden verse afectadas negativamente por el calor, el agua, otros líquidos o la luz solar, lo que hace que se degraden y pierdan su función. Debido a esto, investigamos derivados de vitaminas para superar estos obstáculos de estabilidad. Estos derivados se producen mediante síntesis química y posteriormente se purifican (separan), concentran y formulan para su posterior análisis:
El paso de purificación de la vitamina se realiza típicamente por cromatografía de intercambio iónico o por cromatografía de adsorción.
La cromatografía de intercambio iónico involucra la separación de iones por su adsorción en una fase estacionaria que contiene cargas fijas en su superficie. Los iones de la muestra interactúan con los grupos iónicos de carga opuesta de la fase estacionaria. Se utilizan gradientes de sal o de pH para eluir y aislar las vitaminas. En términos de purificación de vitaminas, la cromatografía iónica es un método rápido, pero solo es adecuado para vitaminas hidrosolubles. El método también requiere el uso de consumibles caros.
En la cromatografía de adsorción, las moléculas se separan por diferentes polaridades. Los compuestos de la mezcla de muestra se disuelven en una fase móvil y se mueven con diferente velocidad a través de la fase estacionaria, que es polar (fase normal) o no polar (fase invertida). La elución se rige por el cambio de polaridad de la fase móvil. En términos de purificación de vitaminas, la cromatografía de adsorción es rentable, fácil de configurar y adecuada para la separación de vitaminas solubles en agua y en grasa. Sin embargo, el método requiere mucho tiempo y requiere control de pH para muestras ionizadas.
Debido a su idoneidad para más tipos de vitaminas, me gustaría centrar esta publicación en la cromatografía de adsorción como método para la purificación de vitaminas.
La cromatografía de adsorción puede ser cromatografía ultrarrápida o HPLC preparatoria. He discutido las diferencias entre estos tipos de cromatografía en una publicación diferente. Tanto la HPLC flash como la Preparativa pueden ser de fase normal o de fase inversa. Una tabla de comparación entre la fase normal y la fase inversa se puede encontrar a continuación:
| Fase normal | fase invertida | |
|---|---|---|
| Fase estacionaria | Polar | no polar |
| Fase móvil | no polar | Polar |
| Sustancias eluidas primero | Sustancias de baja polaridad (la elución de componentes más hidrófilos requiere el uso de disolventes más polares en la fase móvil) | Moléculas hidrófilas (la elución de componentes más hidrófobos requiere una disminución de la polaridad de la fase móvil mediante el uso de disolventes orgánicos no polares) |
| Polaridad del disolvente | Por lo general, aumenta durante la ejecución | Por lo general, disminuye durante la ejecución |
| Fases estacionarias comunes | sílice, amino, diol | C4, C8, C18, amino, diol |
| Fases móviles comunes | Hexano/acetato de etilo Diclorometano/metanol |
Agua/metanol Agua/acetonitrilo Agua/etanol Metanol/acetonitrilo Metanol/diclorometano |
Para la purificación de vitaminas, puede utilizar condiciones de fase normal o reversa. La elección depende principalmente de la solubilidad de las vitaminas. La solubilidad se refiere a la propiedad de qué tan bien se disuelve una muestra en un solvente.
La técnica ideal de carga de muestras para vitaminas es la carga líquida en su sistema de cromatografía, por lo que las vitaminas deben ser solubles al comienzo de la purificación de vitaminas. Pero recuerde considerar la retención de los compuestos en la fase estacionaria. La retención es necesaria para separar el compuesto objetivo de las impurezas. En el caso de que no haya retención, el compuesto simplemente corre con el frente del solvente a través de la fase estacionaria de su columna. Dado que la polaridad de la fase estacionaria y la condición del solvente inicial no pueden ser las mismas, la elección entre la fase normal y la fase inversa en la purificación de vitaminas es a menudo un compromiso.
Permítanme intentar simplificar aún más su purificación de vitaminas con la siguiente tabla de solubilidad de vitaminas que generé en base a la nota técnica de Thermo Fisher: Determinación de vitaminas solubles en agua y grasa por HPLC:
| Vitamina | Solubilidad |
|---|---|
| Vitamina A (Retinol) | Solubilidad en etanol, metanol, cloroformo, éter etílico y aceite; insoluble en agua y glicerol |
| Vitamina B1 (Tiamina) | Soluble en agua, ligeramente soluble en etanol, insoluble en éter y benceno |
| Vitamina B2 (Riboflavina) | Soluble en solución acuosa básica; ligeramente soluble en agua y etanol; insoluble en cloroformo y éter |
| Vitamina B3 (Ácido nicotínico) | Soluble en agua |
| Vitamina B5 (ácido pantoténico) | Soluble en agua, etanol, solución de hidróxido de carbonato alcalino y solución alcalina; insoluble en éter |
| Vitamina B6 (piridoxina/clorhidrato de piridoxal) | Soluble en agua, etanol, metanol y acetona; insoluble en éter y cloroformo |
| Vitamina B9 (Ácido fólico) | Soluble en solución alcalina; ligeramente soluble en metanol; insoluble en agua y etanol |
| Vitamina B12 (Cianocobalamina) | Soluble en agua y etanol; insoluble en éter, acetona y cloroformo |
| Vitamina C (Ácido Ascórbico) | Soluble en agua; ligeramente soluble en etanol; insoluble en éter |
| Vitamina D2 (Ergocalciferol) | Soluble en alcohol, éter y cloroformo; insoluble en agua |
| Vitamina D3 (colecalciferol) | Soluble en alcohol, éter, acetona, cloroformo y aceite vegetal; insoluble en agua |
| Vitamina E (Tocoferol) | Soluble en alcohol, éter, acetona, cloroformo y aceite; insoluble en agua |
| Vitamina K (Filoquinona) | Soluble en éter, acetona y cloroformo; ligeramente soluble en aceite y metanol; insoluble en agua |
Examinemos estas vitaminas en función de su solubilidad para encontrar las condiciones óptimas de purificación de vitaminas.
Purificación vitamínica de vitaminas hidrosolubles.
Las vitaminas solubles en agua se pueden disolver en agua. La mayoría de estos tipos de vitaminas no se almacenan en el cuerpo, por lo que deben consumirse a diario. Cualquier exceso de vitaminas absorbidas normalmente se elimina a través de la orina. Las vitaminas solubles en agua generalmente se purifican mediante cromatografía de fase inversa usando agua y bajas concentraciones de un solvente orgánico, como acetonitrilo o metanol. Puede usar tampones comunes como fosfato, ácido fórmico y ácido acético para controlar el pH. Si utiliza disolvente con concentraciones de agua superiores al 95 %, le recomiendo que utilice una fase C18 con protección polar en los extremos de su cartucho para evitar el colapso de las cadenas alquílicas.
Purificación vitamínica de vitaminas liposolubles.
Las vitaminas liposolubles se pueden disolver en grasas/lípidos. Este tipo de vitaminas se absorben en glóbulos de grasa que viajan en la circulación sanguínea general a través del sistema linfático del intestino delgado. Una vez dentro del cuerpo, las vitaminas solubles en grasa generalmente se almacenan en el hígado y los tejidos grasos, donde permanecen hasta su uso posterior. Las vitaminas liposolubles se pueden purificar mediante cromatografía de fase reversa usando solventes menos polares, como diclorometano (DCM), acetonitrilo y metanol. Si está trabajando con vitaminas muy no polares, puede probar la cromatografía de fase normal con solventes orgánicos no muy polares, como el hexano y un solvente polar medio como el acetato de etilo.
Purificación vitamínica de vitaminas altamente polares
Por lo general, no se pueden separar las vitaminas altamente polares mediante cromatografía de fase normal o de fase inversa. En condiciones de fase normal, los compuestos son demasiado pegajosos en la fase estacionaria polar, por lo que la elución tardaría demasiado. Los compuestos polares también muestran una buena solubilidad en fases móviles acuosas y, por lo tanto, no son muy compatibles con los disolventes típicos de fase normal. Si prueba la fase inversa en su lugar, se encontrará con diferentes problemas. Los compuestos altamente polares no interactúan en absoluto con la fase estacionaria no polar de su columna. En cambio, es probable que sus vitaminas altamente polares se eluyan con el frente del solvente y no se produzca ninguna separación. Recomendaría probar un método de cromatografía alternativo, a saber, la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) en su sistema de cromatografía.
Esta es toda la información vital sobre la purificación de vitaminas que tengo para usted en pocas palabras. Pero si está interesado en profundizar más y complementar más esta publicación de blog, no dude en consultar un buen recurso gratuito sobre el uso de la cromatografía para la purificación de vitaminas o una excelente hoja de ruta de investigación de vitaminas para algo un poco más visual o un seminario web de vitaminas para algo súper visual. ¡Podría ser el microconocimiento que necesita para obtener un macro impulso en la separación de sus vitaminas!
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Denoulet Bart
Texto extraído del Blog de Bart de BUCHI. Para mas información acceda al Blog original haciendo clic aquí
