¿Los compuestos de su muestra están superando su método de detección por cromatografía?
Bart nos ofrece una descripción general de cinco métodos de detección comunes en cromatografía en su nuevo post. Lea el artículo completo aquí.
Usted ya sabe que hay muchos compuestos escondidos en su muestra. Sabe también que su ejecución de cromatografía está configurada para separaciones óptimas. ¿Pero ha pensado en su método de detección? ¿Está seguro de que puede reconocer todo lo que es importante para usted en sus fracciones? En este articulo presentamos cinco detectores diferentes, UV, ELSD, MS, RI y fluorescencia, discutiremos sus beneficios y limitaciones y obtendrá sugerencias sobre para qué compuestos es más adecuado para cada detector.
Comencemos con los métodos de detección con los que ya deberíamos estar familiarizados.
Detectores UV
Estos son los detectores más utilizados en cromatografía preparativa. Este método de detección es selectivo, ya que solo se puede utilizar para medir sustancias que absorben luz en el rango ultravioleta (200 a 400 nm) o rango visible (400 a 800 nm). Las sustancias que puede observar con éxito con un detector UV contienen un grupo cromóforo, como:
◾Anillo aromático
◾Dos dobles enlaces conjugados
◾Doble enlace adyacente a un átomo con un par de electrones
◾Grupo carbonilo
◾Bromo, yodo o azufre
El detector UV de su sistema de cromatografía mide el cambio de intensidad de un haz de luz UV que pasa a través de una solución. La absorción de la luz está relacionada con la concentración de la solución a través de la cual viaja el haz de luz. La relación está descrita por la Ley de Lambert-Beer:
Donde:
E = Extinción [adimensional]
ε = Coeficiente de extinción [M–1· cm–1]
c = Concentración de la solución [mol/l]
d = Longitud del camino del haz de luz a través de la solución [cm]
Cada solvente que usa tiene una longitud de onda de corte de absorbancia UV característica. A longitudes de onda inferiores a este valor, el propio disolvente absorbe toda la luz.
Cuando utilice un detector UV, debe seleccionar un disolvente que no tenga una absorción UV significativa en la longitud de onda en la que se van a realizar las mediciones. De lo contrario, la señal de la sustancia y el solvente se superpondrán, lo que dará como resultado un fraccionamiento incorrecto.
Si no conoce el espectro de absorción de su compuesto, le recomendaría que use múltiples longitudes de onda simultáneamente o incluso un detector de matriz de diodos (DAD), que puede registrar todo el espectro UV. El gráfico resultante ofrecería más información para el usuario:
Para concluir el método de detección UV, me gustaría repasar algunas ventajas del método. Los detectores UV son fáciles de usar, confiables, relativamente económicos, compatibles con gradientes de solventes, no destructivos para la muestra y relativamente sensibles y específicos. Las desventajas del método de detección UV son que los compuestos que carecen de un buen grupo cromóforo son difíciles de detectar y los solventes están limitados por el corte UV, especialmente en longitudes de onda UV bajas.
ELSD
Los detectores ELS funcionan midiendo la cantidad de luz dispersada por partículas de disolvente que se han secado por evaporación. El proceso consta de tres pasos: nebulización, evaporación del solvente y detección. Durante la nebulización, un nebulizador combina un flujo de gas de aire o nitrógeno con el efluente de la columna o cartucho para producir un aerosol de pequeñas gotas. En el segundo paso, las gotas entran en un tubo de deriva, donde la fase móvil se evapora y deja atrás una forma de partículas del compuesto objetivo. En el paso final, la luz golpea las partículas secas que salen del tubo de deriva. La luz se dispersa y los fotones resultantes son detectados por un fotodiodo.
La ecuación matemática que describe ELSD se rige por el tamaño de las partículas:
A = amb
Donde A es el área del pico
Donde A es el área del pico
m es la masa del soluto
a y b son constantes que dependen de una variedad de factores, como el tamaño de las partículas, la concentración y el tipo de sustancias objetivo, el caudal de gas, el caudal de la fase móvil y la temperatura del tubo de deriva.
El método de detección ELS es ideal si desea purificar compuestos sin un grupo cromóforo. Así es, exactamente los compuestos que no se pueden detectar fácilmente con un detector UV. Estos tipos de compuestos incluyen carbohidratos, lípidos, grasas y polímeros.
La función de los detectores ELS no se ve afectada por las variaciones de la fase móvil y el cambio de la línea de base del gradiente. La sensibilidad del método de detección ELS es independiente de las propiedades físicas y químicas del compuesto y solo está influenciada por la cantidad absoluta del compuesto. Como ELSD es un detector dependiente de la masa, una señal alta indica que se está eluyendo una gran cantidad de compuesto. Debido a que el detector es semicuantitativo, puede obtener información valiosa sobre la relación de los compuestos en la muestra.
ELSD puede detectar casi todos los compuestos, excepto los analitos altamente volátiles, por ejemplo, el etanol en el vino. Generalmente, el compuesto de interés o el modificador agregado debe ser menos volátil que la fase móvil. ELSD también destruirá su muestra, por lo que debe tratar de usar cantidades de muestra más pequeñas.
Cuanto más bajo sea el punto de ebullición de la fase móvil, más fácil será que el solvente se evapore. Las fases móviles con puntos de ebullición elevados, como DMS, DMF, tolueno o agua, necesitan evaporarse a altas temperaturas. Sin embargo, este enfoque conlleva el riesgo de destruir las sustancias objetivo. Alternativamente, los solventes se pueden nebulizar en gotas extremadamente pequeñas para permitir la evaporación incluso a temperatura ambiente.
Ahora veamos algunos métodos de detección que no hemos explorado antes en el blog.
Espectrometría de masas (MS)
El espectrómetro de masas, como detector de cromatografía, permite la identificación de especies según cada pico de cromatografía en función de su espectro de masas único. Un sistema de cromatografía líquida junto con un detector MS tiene el siguiente flujo de trabajo. En primer lugar, las moléculas se convierten del eluyente de la cromatografía a un estado cargado o ionizado. El analizador de masas es el componente del espectrómetro de masas que toma masas ionizadas y las separa en función de la relación carga-masa. Luego, el analizador los envía al detector, donde se reconocen y se convierten en salida digital.
Los beneficios de los métodos de detección de MS incluyen buena sensibilidad, selectividad y la posibilidad de obtener información estructural. Las desventajas del detector MS son el precio de compra y el mantenimiento frecuente que requiere el dispositivo. Para mí, la ESpectrometría de masas no tiene cabida en un laboratorio de síntesis típicamente abarrotado y ocupado.
Índice de refracción (RI)
El detector de índice de refracción mide los cambios en la refracción de la luz causados por un medio a medida que fluye a través de una celda de medición. Este método de detección no es selectivo, ya que detecta todas las sustancias que fluyen a través de la celda. Los detectores RI miden según el siguiente principio:
Las limitaciones del método de detección de RI incluyen:
∆n= Diferencia entre los índices de refracción
nG = Índice de refracción de la muestra disuelta
nL = Índice de refracción del disolvente puro
ni = Índice de refracción de la muestra
c = Concentración de la muestra
Las ventajas del método de detección de RI incluyen:
◾Naturaleza universal de la respuesta del detector
◾Buen rango dinámico lineal – ~ 4 órdenes de magnitud
◾Fácil de operar
Las limitaciones del método de detección de RI incluyen:
◾No se puede utilizar con gradientes de disolvente.
◾Baja sensibilidad
◾Muy sensible a las fluctuaciones de temperatura y presión.
Detector de fluorescencia
Cuando los compuestos con grupos funcionales específicos se excitan con energía de longitud de onda más corta, emiten radiación o fluorescencia de longitud de onda más alta. La intensidad de la fluorescencia se rige tanto por la longitud de onda de excitación como por la de emisión, lo que permite la detección selectiva de algunos componentes sobre otros. Alrededor del 15% de todos los compuestos tienen fluorescencia natural.
Los compuestos alifáticos y alicíclicos con grupos carbonilo y los compuestos con dobles enlaces altamente conjugados tienen fluorescencia natural. Los componentes aromáticos con electrones pi conjugados emiten la actividad de fluorescencia más fuerte.
Las principales ventajas de los detectores fluorescentes incluyen:
◾Alta sensibilidad: la sensibilidad de los detectores de fluorescencia es de 10 a 1000 veces mayor que la de los detectores UV
◾Alta selectividad
◾Generalmente insensible al flujo y al cambio de temperatura
Las desventajas del método de detección de fluorescencia incluyen:
◾Linealidad limitada
◾No muchos compuestos son naturalmente fluorescentes
◾El método de derivatización es complicado.
◾Uso complicado del detector: debe tener un conocimiento sólido de las variables químicas y del instrumento.
◾Algunos productos químicos, como el oxígeno, pueden apagar la fluorescencia; debe tener especial cuidado al desgasificarlos.
Estos cinco métodos de detección deberían ayudarlo a identificar cualquier compuesto en su muestra. SI desea obtener mayor información ingrese a los artpiculos relacionados de abajo o comuníquese con nosotros por medio del chat.
Denoulet Bart
Texto extraído del Blog de Bart de BUCHI. Para mas información acceda al Blog original haciendo clic aquí
